A Bocskai-zászló, amelyet a hagyomány szerint a fejedelem adományozott a hajdúvitézeknek, a Bocskai István Múzeum anyagának egyik legértékesebb darabja.

A múzeum központi épületében látható a Hajdúszoboszló története a kezdetektől napjainkig című várostörténeti gyűjtemény.  Rendkívül szép darabok a városigazgatás emlékei, a bírói szék, a bilincs, a városláda, a tűzjelző kürt és a különböző pecsétnyomók. Jelentősek az egyletek és a dalárdák zászlói, valamint a Hajdúszoboszlóhoz kötődő neves emberek - többek között Gönczy Pál, Szép Ernő, Fehér Gábor, Hőgyes Endre, Kenézy Gyula, Pávai Vajna Ferenc - tárgyi emlékei.
A tájegységre jellemző rovargyűjtemény, és a lepkékből álló látványos egység is a múzeumban kapott helyet.
A mezőgazdaság-történeti kiállítás, amely a XIX-XX. század fordulójának technikai eszközeit vonultatja fel, egyedülálló a környéken. A múzeum udvarán, a 100 négyzetméteres fedett színben látható, itt állították ki továbbá az Oborzil Edit és a Jeney Tibor művészházaspár által alumíniumból, különleges technológiával készített harangok együttesét.